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蛋白的定量浓度尝试之恒温培养箱应用

发表时间:2019-04-16  |  点击率:288

     今天喆图小编来给大家讲讲用恒温培养箱做蛋白定量浓度尝试:

     1、吸弃培养皿中的培养液。

     2、往培养皿中到场2ml冷的PBS轻轻荡洗2~3次,MAX后一次,吸干培养皿中的PBS。

     3、每个培养皿中到场70μl(以FLS细胞为例)裂解液。

裂解液的配置:

     RIPA裂解液:蛋白酶/磷酸酶按捺剂混合物:RIPA裂解液(中)B液=100:1:1

     4、将到场裂解液的培养皿轻轻摇晃,使裂解液与贴壁细胞充分接触,放入—70℃的低温冰箱,冷冻10分钟。

     5、裂解完后,用干净的刮刀将细胞刮于培养皿的一处,然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。

     6、将离心管置于小型离心机上涡旋一下,然后置于4℃低温冰箱放置30min。

     7、将离心管放入高速离心机,于4度下12000rpm离心5min。

     8、取出离心管,汲取上清液,上清液即蛋白液,对其进行定量,转移至新的1.5ml离心管。

     9、对提取的上清液进行蛋白浓度的定量

蛋白定量的过程

     ①取干净的96孔板,进行区域抉择板底扫描即读板

     ②首先在96孔板中到场18ul的PBS

     ③在18ul的PBS中到场2ul的样品

     ④MAX后在到场200ul的BCA(到场后的BCA不进行与样品的混合,而是铺在样品的上面,用吹风机除去上方的气泡)

     BCA的配置:BCA试剂A:BCA试剂B=50:1

     ⑤放置37°恒温培养箱孵育30min

     ⑥读板(吸光光度值为562)

     10、对剩余的样品按照体积5:1的比例到场Loading Buffer(6X)

     11、将加好的样品放入离心机顺离,使离心管内壁的样品甩下。

     12、将样品放入恒温金属浴锅中100℃煮7min

     13、将煮好的蛋白放入—20℃低温冰箱中备用

    以上内容由喆图小编编辑发布,如需了解恒温培养箱详情请联系喆图客服!

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