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用恒温水浴锅提取动物组织细胞基因组DNA

发表时间:2019-06-11  |  点击率:412

        一、仪器及试剂

        ⒈仪器:

恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计(GeneQuant)、移液器、玻璃匀浆器、离心管(灭菌)、吸头(灭菌)

        ⒉试剂:

(1)细胞裂解缓冲液:

Tris (pH8.0) 100 mmol/L

EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L

NaCL 20 mmol/L

SDS 10%

胰RNA酶 20ug/ml

(2) 蛋白酶K: 称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中,?C20℃备用。

(3)TE缓冲液(pH 8.0):高压灭菌,室温贮存。

(4)酚: CHCl3:异戊醇(25:24:1)

(5)异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。

        二、操作步骤

        ⒈取新鲜或冰冻动物组织块0.1g(0.5cm3),尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中,到场1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块,转入1.5ml 离心管中,到场蛋白酶K (500ug/ml)20μl,混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min,也可转入37℃水浴12~24h,间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中。

        ⒉加2倍体积异丙醇,倒转混匀后,可以看见丝状物,用100ul 吸头挑出,凉干,用200ul TE 从头溶解。(可进行PCR反应等,需要进一步纯化的按下列步骤进行)

        ⒊加等量的酚? CHCl3?异戊醇振荡混匀,离心12000 rpm,5min。

        ⒋取上层溶液至另一管,到场等体积的 CHCl3?异戊醇,振荡混匀,离心12000 rpm,5min。

        ⒌取上层溶液至另一管,到场1/2体积的7.5mol/L乙酸氨到场2倍体积的无水乙醇,混匀后室温沉淀2min ,离心12000 rpm ,10min。

        ⒍小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉。

        ⒎用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次,离心12000 rpm , 5min。

        ⒏小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉,室温干燥。

        ⒐加200ul TE从头溶解沉淀物,然后置于4℃或?C20℃保存备用。

        ⒑汲取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。

        三、常见问题

        ⒈抉择的尝试材料要新鲜,处理时间不易过长。

        ⒉在到场细胞裂解缓冲液前,细胞必须均匀分散,以减少DNA团块形成。

        ⒊提取的DNA不易溶解:不纯,含杂质较多;加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥,也将使溶解变得很困难。

        ⒋电泳检测时DNA成涂布状:操作不慎;污染核酸酶等。

        ⒌分光光度阐发DNA的A280/A260小于1.8;不纯,含有蛋白质等杂质。在这种情况下,应到场SDS  至终浓度为0.5%,并重复步骤2~8。

        ⒍酚/ CHCl3/异戊醇抽提后,其上清液太黏不易汲取:含高浓度的DNA,可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。

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