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用电热恒温培养箱培养大肠杆菌

发表时间:2020-01-09  |  点击率:456

尝试所需仪器:超净台、离心机、高压灭菌锅、电热恒温培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器

尝试所需试剂:牛肉高蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液(50mg/ml)、生理盐水

2.2尝试方法

2.2.1制备培养基 

  普通培养基——牛肉高蛋白胨培养基(400ml):

牛肉高5g蛋白胨10gnacl5g琼脂20g蒸馏水1000mlph7.0

  按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min,倒平板,4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml

  筛选培养基(200ml):含抗生素50mg/L。(卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素,能结合细菌核糖体的30s亚基上的16srRnA,阻断细菌蛋白质的合成。)

  牛肉高5g蛋白胨10gnacl5g琼脂20g蒸馏水1000mlph7.0硫酸卡那霉素水溶液(50mg/ml)0.2ml,按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min灭菌,取出培养基后冷却至60℃时将硫酸卡那霉素0.2ml到场培养基中,充分震荡混匀,倒平板,2皿*15ml*5组+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml2.2.2制备菌悬液(106~108个/mL)

  ①固体培养:大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基,37℃培养24-48h。

  ②菌悬液:用适量生理盐水刮洗菌落,倒入一个无菌小三角瓶(或试管)中,充分振荡使菌

  体散开,得到菌悬液。

  ③菌悬液浓度用血球计数板计数

  使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数。将菌液滴在血球计数板0.1ml的计数格中,细菌被固定染色后,在显微镜下抉择数出若干个小格中的细菌数目,(一般数125个小格),按照比例关系折算出单元体积菌液中细菌的数量。

  血球计数板规格:计数格=4*4=16大格1大格=5*5=25小格

  小格体积=0.05*0.05*0.1=0.00025mm3=2.5*10-7ml(长*宽*高)

  计算方法例如:125格中90个细菌,则(90÷125)÷(2.5*10-7)个/ml=2.88*106所以,125格中的细菌大约在31(4格1个菌)—3125(每个小格25个菌)个。2.2.3诱变处理及接种

  ①将紫外灯打开,预热30min;

  ②取无菌培养皿(Φ90mm,含无菌大针),到场稀释好的菌悬液8ml以覆盖培养皿底面为宜。

  ③将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上,开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌1分钟,然后打开皿盖,分别处理10s、20s、40s、80s、160s(可以累积照射),照射完毕后先盖上皿盖,再关闭搅拌和紫外灯;

  ④每个照射剂量分别取0.5ml分别稀释1000倍和100倍,然后取稀释液0.1ml

  做普通培养基的涂布培养,每个处理两个重复;同时每个照射剂量取0.1ml照射液直接做两个筛选培养基的涂布培养。⑤对照涂布培养:将照射的菌液稀释1000倍,在稀释液中取0.1ml做2个普通培

  养基涂布培养,2个筛选培养基的涂布培养。涂布要均匀,培养基表面无液流。⑥37℃培养24h后,计数,统计阐发。对于筛选的抗性菌种进行验证、纯化。

  2.2.4.结果计数、阐发、统计及讨论

  ①以辐射时间为横坐标,以存活菌落数的lg值为纵坐标,作紫外线对大肠杆菌致死效应曲线。

  ②列公式计算不同辐射剂量下的致死率。

  照射前活菌数/ml?照射后活菌数/ml

  照射前活菌数/ml

  ③计算并比较不同辐射剂量下大肠管杆菌的抗药突变率,并阐发不同辐射剂量的诱变效果差异原因

  突变率=筛选平板菌数/普通平板菌数*100%④抗药性菌株的筛选与纯化

  将一抗性克隆划线到一新的抗性平板上,与对照菌相比较,观察生长状况

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