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使用二氧化碳培养箱完成细胞复苏实验

发表时间:2021-07-09  |  点击率:211

(1) 准备

   无菌超净台,酒精灯,75%酒精喷壶,二氧化碳培养箱,37℃水浴锅,离心机;培养瓶,含10%胎牛血清的完全培养基和基础培养基以及PBS磷酸缓冲液(提前放置超净台使平衡到室温),无菌工作服(白大褂),手套,记号笔

(2) 步骤

   1.穿好无菌工作服,带上*罩和手套,快速从液氮里取出冻存管,快速放进37℃水浴锅缓慢摇晃使细胞解冻,注意冻存管的封口膜不要破裂,防止污染。

   2.解冻后用纸擦干冻存管表面的水滴,酒精喷壶喷洒适量75%酒精消毒冻存管封口处。

   3.开超净台,点燃酒精灯燃烧片刻后(可提前准备),冻存管放超净台,换新手套,小心打开冻存管,避免污染,无菌吸管将1ml细胞全部吸出至5ml无菌EP管,补加9ml基础培养基稀释,1000rpm,离心5min使细胞沉淀,弃上清。

   4.加入新鲜配制的含10%血清的培养基4ml,轻轻混匀,用吸管将细胞移至25T培养瓶。

   5.平躺放置培养瓶,8字形混匀后,置于37℃,5%二氧化碳培养箱培养。

   6.培养24小时后,显微镜观察细胞(贴壁细胞)贴壁后,小心更换培养基,根据不同细胞的生长状态进行传代培养,培养瓶上标记:操编辑,时间,细胞类型。

   7.有的实验员的培养基会加入抗生素防止细胞污染,但是这对于掌握细胞培养是非常不利的,不加抗生素培养细胞更能提醒实验者无菌操作的意识。一旦细胞出现污染,易于发现,一旦发现污染的细胞应立即煮沸丢弃,以免污染同实验室其他细胞。

   8.细胞长满90%-100%即可传代,小心打开培养瓶,瓶口过酒精灯消毒,弃培养基。

   9.加入1mlPBS,润洗细胞,重复3次,弃PBS。

   10.加入4ml完全培养基,用无菌吸管小心吹打贴壁细胞或者用胰蛋白酶消化细胞使细胞脱落。

   11.转移1/2脱落的细胞至新的培养瓶,各瓶补加完全培养基至4ml。

   12.小心封口,平躺放置培养瓶,8字形混匀后,置于37℃,5%二氧化碳培养箱培养。

   13.待长满后,按同样的方法传代培养。二  冻存

当不需要使用细胞或者细胞量足够时,可以将细胞冻存起来,供以后实验用

(1) 准备自

    细胞冻存液(20%血清、10%DMSO、70%基础培养液),梯度降温盒

(2) 步骤

        1.选取活力好,密度约70%细胞用于冻存,此时细胞处于对数生长期,用于冻存。

        2 .细胞吹打或者胰酶消化后,转移至无菌EP管,1000rpm里面5min。

        3.弃上清,加入新鲜配制的细胞冻存液,25T细胞可以加入2ml细胞冻存液,分装2个冻存管,细胞*密度为5*106-1*107个每ml。

        4.做好标记,放入梯度降温盒(提前平衡至室温)。

        5.将梯度降温盒放入-80℃冰箱过夜,DI二天取出冻存管,快速放入液氮保存。

氧化碳培养箱是进行细胞培养的必要设备,那么在培养细胞时有哪些经验是大家可以借鉴的呢?下面让大家一起来看一下。

1、启蒙老师的重要性

一般进实验室都有师兄师姐带着做,他们就是你做细胞的启蒙老师。他们的操作手法、细节、理论讲解就成了你操作的准则,如营养液、细胞瓶的摆放位置;灭菌处理程序;开盖手法;细胞吹打手法等等。要学会他们的正确操作,在DI一次的时候就要重视。

2、像养孩子一样养细胞

细胞真的很脆弱,*好每天都去看看它,以防止出现培养箱缺水、缺二氧化碳、停电、温度不够等异常现象,也好及时解决这些意外,避免重复实验带来的更大痛苦。

3、好细胞要及时保种

细胞要分批传代,这样即使有一批出了问题,还有一批备用的。像后者一般人可能不容易做到。有一次细胞污染了,全军覆没。当时可悔恨没有保种。

4、每种细胞都有自己的特性,要区别对待。

细胞跟人一样,不同的细胞,培养特性是不一样的。培养过程中要细细体会。不同细胞株使用不同的培养基和血清。

如平滑肌细胞很活跃,喜欢热闹,2~3 天就好多人口,而且不太爱吃喝,真是*好养的孩子了。内皮细胞和平滑肌细胞性格相近,不过它很不讲卫生,也很邋遢,里面有很多分泌屋,要经常换洗才行。RAW264.7 细胞也很开朗,而且很能吃,要经常喂它,头疼的是细胞很容易活化,培养它的瓶子和环境没有内毒素才好。

5、培养前的工作准备充分

包括耗材的处理、试剂的配置,无菌检验等等。
玻璃器皿的清洗。对于玻璃器皿(细胞瓶、装营养液的瓶子、小青霉素瓶等)要先用洗衣粉刷干净(注意死角),然后冲干净。用酸液浸泡 24 h 以上,之后用清水冲洗 10 遍,除去残留酸液。瓶子之类,冲洗过程要使劲摇晃。然后在双蒸水浸泡 24 h。晾干后包扎,160℃ 干烤 2 h 待用。
试剂配置。细胞培养用的液体一般使用双蒸以上的水即可。并注意 pH 值的调节。
无菌检验。主要采用过滤除菌:如胰酶、抗生素、G-418 溶液、各类培养基、丙酮酸钠、谷氨酰胺等。有些可以采用高压灭菌:如 PBS、D-Hank's等。

6、试剂分装保存

包括营养液、胰酶、血清等。

血清特别重要。血清必须贮存于 –20℃,如果一次无法用完一瓶,可将 40~50ml 分装于无菌酸处理瓶中,甚至置青霉素瓶保存。一般厂商提供的血清为无菌,不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物,则可将血清加入培养基内一起过滤,勿直接过滤血清。(一般情况下不影响细胞培养)

瓶装血清一定要逐步解冻: 4℃ 冰箱全溶后再分装,在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沉淀的发生。勿直接由 –20℃ 直接至 37℃ 解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

热灭活是指 56℃,30 分钟加热已完全解冻之血清。水浴锅升到 56℃后,将血清放入,待温度升高到 56℃ 后计时,一般 5 分钟左右规则摇晃均匀一次。此热处理之目的是使血清中之补体成份去活化。除非必须,一般不要作此热处理,因为会造成沉淀物之显著增多,且会影响血清之品质。注意更换新血清(包括不同批次)对细胞的影响。

7、无菌意识要强

实验进行前,超净台以紫外灯照射 30 分钟灭菌,以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面,并开启超净工作台风扇运转数分钟后,才开始实验操作。

每次操作只处理一株细胞株,以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。

无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如支架、吸管等公用物品可以暂时放置,其它个人实验用品用完应马上拿出。实验用品以 70% 乙醇擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在中央无菌区域,一般勿在边缘区域操作。

小心取用无菌之实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约 45° 角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

8、选择正确的培养基 

不同的细胞可能培养基不同,甚至不同的文献可能对相同的细胞培养基成分也是可能不同的。如我当时培养神经干细胞,有文献就选用 neurobase 培养基,而我的实验目的主要是做抗氧化和氧化方面的,而这种培养基中含有抗氧化剂成分,此时,我就不得不选择另外一种不含抗氧化剂的培养基。

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