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噬神经元的腺病毒载体的构建

发表时间:2021-07-13  |  点击率:139

实验试剂


人类胚胎肾(HEK)293T细胞

腺病毒转移载体质粒

腺病毒包装载体PLP1,pLP2(之前),PLP / VSVG

DMEM培养基

青霉素,链霉素-谷氨酰胺(100X)

磷酸盐缓冲液PBS(-)

胎牛血清

凝聚胺
实验设备

 

10-cm的细胞培养皿

50毫升锥形离心管

Steriflip-GP过滤器(0.22微米)
超离心管17.0mL

5%二氧化碳培养箱

荧光显微镜

生物安全柜

离心机

 

 
实验材料


2.5M氯化钙溶液:36.75克氯化钙,70毫升双蒸H 2 O,通过0.22μm滤膜过滤,体积调制100毫升

2X HEPES缓冲:氯化钠280 mM,50mM肝素钠,1.5mM的Na2 HPO4 (pH值7.05)
实验步骤


腺病毒载体的构建和浓度

第1天: HEK细胞的培养

1.收集预融合的HEK 293T细胞,细胞培养于完全DMEM培养基中(含10%FBS,50 U/ml的青霉素G和50μg/mL链霉素的,pH值7.35)。

2.将收集的浓度为1×106 的HEK 293T细胞接种于直径10cm的培养皿中,加入10mL完全DMEM培养基。漩涡震荡使细胞均匀分布, 37℃培养24h。

第2天:转染

3.观察第1天培养的细胞,细胞应铺满约60%。

注意:细胞长满80%会导致收获病毒时PH偏低。

4.更换DMEM培养基(10%FBS,10mL),继续孵育于二氧化碳培养箱30min。

5.将10µg腺病毒转移载体与10µg包装混合物混合,用无菌ddH2 O稀释质粒至总体积450μL。

6.向质粒中加入50μL 2.5 M氯化钙混匀,然后加入500μl 2xHEPES缓冲液,涡旋。

7.将所有的转染混合物加入(散开)培养板,轻轻震荡,继续培养于5%二氧化碳培养箱过夜(16h)。

第3天:观察细胞和更换培养基

8.观察细胞

注意:细胞不能达到饱和状态,应该有供细胞分裂生长的空间,因为细胞铺满后培养基的pH值会迅速下降。

9.吸出培养基,加入5mL预热的PBS(-)洗两次细胞,然后加入9.5mL新鲜培养液的DMEM培养基, 5%CO 2 培养箱继续培育,37℃过夜。

第4天:收获细胞和浓缩病毒颗粒

10.转染40h后收集上清液。

注意:收集时培养基颜色应该是红色的(酚红的颜色),(pH值7.20或更高)在这个pH值内病毒培养较好,因此,不要使用从第二次收获的细胞。为了获得优先转染胶质细胞的腺病毒载体,应使用病毒转染后2d或3d的细胞。此外,最好使用充足胎牛血清培养的细胞。

11.通过0.22微米的过滤器过滤,清除上清液中的细胞碎片。

12.超速离心浓缩病毒颗粒。4℃,用吊桶式转头离心上清120000xg,1.5h。将2个培养板(约18mL)的上清浓缩于一管。

13.倒掉上清液,沉淀几乎看不见。

14.用90μL PBS(-)重悬病毒颗粒。病毒悬浮液,可用于在体外和体内实验:但是,如果需要纯净级的质量,可通过如下步骤纯化病毒。

腺病毒载体滴度的测定

腺病毒载体的滴度通过HeLa细胞的转染来测定。虽然滴度可以在13步后就可以计算,但为了缩短整个过程大家通常从第3天开始计算。

第3天:HeLa细胞播种

15.将 1×105 的的HeLa细胞接种于含1mLDMEM培养基(10%FBS)的12孔板,添加聚凝胺至浓度为6 µg/ml。在5%CO2 培养箱孵育,37℃过夜。

第4天:腺病毒载体的感染HeLa细胞

16.用PBS 10倍梯度稀释的病毒(稀释从10 -3 到10 -6 )。实际测试的范围将取决于病毒制剂的浓度。17.将每个梯度稀释的病毒加入单层生长的HeLa细胞,轻轻摇匀, 337℃培养。

第5-8天:腺病毒载体的滴度测定

18.细胞再生长3天(感染后总88h),绿色荧光蛋白染色后48h可见。然而,这个时间根据滴定用腺病毒载体和细胞株不同而有所不同。

19.检测标记细胞百分比:如果标记是绿色荧光蛋白,计数绿色荧光蛋白表达的细胞。

20.如前所述计算生物滴度(TU/ml,转染单位)。

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