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滤纸糖化力法测定纤维素酶活性条件的研究

发表时间:2018-09-07  |  点击率:1315

       今天喆图小编就来说说利用蛋白质分离纯化方法,从枯草芽孢杆菌中分离出纤维素酶,将其分别作用于羧甲基纤维素(CMC)和滤纸,其生成的还原性糖能和3.5--二硝基水杨酸(DNS)反应生成棕红色物质,利用分光光度法测出纤维素酶的活性强度。

           纤维素酶 

滤纸糖 ———— 纤维二糖、葡萄糖等还原性糖 +DNS ———— 棕红色物质

 

所需药品材料:氢氧化钠、葡萄糖、3.5--二硝基水杨酸(DNS)、硝酸、冰醋酸、醋酸钠、酒石酸、滤纸、纤维素酶制剂。

试验需用仪器:分光光度计、电热恒温水浴锅鼓风干燥箱、分析天平

实验设计:

一、实验前期准备工作:

       1、醋酸-醋酸钠缓冲液的配制:量取冰醋酸6ml,定容至1000ml,制成0.1mol/L醋酸溶液。 称取8.2g醋酸钠,溶解后容至1000ml,制成0.1mol/L醋酸钠溶液。使用时以4:6的比例混合,放入低温保存箱中冷藏备用。

         2、葡萄糖溶液的配制:将葡萄糖在鼓风干燥箱中105℃下干燥至恒重,准确称取100mg 于100mL 小烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,移入100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至100mL,充分混匀。

         3、3.5--二硝基水杨酸的配制:准确称取DNS 6.3g于500mL 大烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,加入2mol/L NaOH 溶液262mL,再加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠(C4H4O6KNa · 4H2O,MW=282.22)的热水溶液中,再加5g结晶酚(C6H5OH,MW=94.11)和5g无水亚硫酸钠(Na2SO3,MW=126.04),搅拌溶解,冷却后移入1000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL,充分混匀。

          4、葡萄糖标准曲线的绘制:取8支洗净烘干的25mL 具塞刻度试管,编号后依次加入0ml 0.2ml 0.4ml 0.6ml 0.8ml 1.0ml 1.2ml1.4ml葡萄糖标准溶液,然后用蒸馏水分别定容至2.0ml。配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后,向各试管中加入1.5mL DNS溶液,摇匀后放入水浴锅中沸水浴5min,取出冷却后用蒸馏水定容至25mL,充分混匀。在540nm 波长下,以1号试管溶液作为空白对照,调零点,测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。以葡萄糖含量(mg)为横坐标,以对应的光密度值为纵坐标,在坐标纸上绘制出葡萄糖标准曲线。

滤纸对实验的影响分析:由于滤纸中也含有一定量的还原性糖,所以试验中应该排除底物对实验的影响。称取等量碾碎的滤纸与DNS充分反应,测其OD值。

酶促反应时间的研究:酶的反应时间不同,其产物浓度也不一样。依次取反应时间为0min 2min 4min 6min 8min 10min 12min14min的反应体系,加入DNS充分显色测其OD值。

DNS试剂量的确定:DNS本身也具有一定的颜色,如果过量也会对实验结果造成影响,所以应该设计实验确定DNS的加入量。取相同酶反应体系,分别加入0.3ml 0.6ml 0.9ml 1.2ml 1.5ml 1.8ml 2.1ml 2.4ml显色剂DNS充分显色,测其OD值。

吸取波长的确定:取450nm-590nm波长段,以每20nm一个区段,分别测其OD值,分析结果。

沸水浴显色时间的确定:取相同酶反应体系,DNS沸水显色分别取1min 3min 5min 7min 9min 11min 13min 15min的OD值,分析结果。

显色后吸光度稳定性的研究:分别测量反应体系显色后15min 20min 25min 30min 35min 40min 45min 50min的吸光度,分析结果。

以上内容仅供参考,如需了解详情请联系喆图客服。

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