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枯草杆菌黑色变种芽孢悬液的制备

发表时间:2019-04-11  |  点击率:428

      1、以无菌操作方式开启菌种管,加入适量营养肉汤培养基,吹吸数次,使菌种融化分散。取含 5.0mL~10.0mL 营养肉汤培养基试管,滴入少许菌种悬液,置 36℃±1℃ 培养 18h~24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液,划线接种于营养琼脂培养基平板上,置 36℃±1℃ 培养 18h~24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落,接种于营养肉汤培养基,置 36℃±1℃ 培养 18h~24h,即为第 3 代培养物。

      2、 用 10.0mL 吸管汲取 5.0mL~10.0mL 第 3代~5代的 18h~24h 营养肉汤培养物,接种于罗氏瓶营养琼脂培养基表面,将其摇动使菌液布满培养基表面,将多余肉汤培养物吸出,罗氏瓶置 36℃±1℃ 恒温培养箱内培养 5d~7d。

      3、用接种环取少许菌苔涂于玻片上,以改良芽孢染色法染色。改良芽孢染色法:用接种环取菌苔涂于玻片上,自然干燥后,通过火焰加热将菌固定于玻片上;将涂片放入平皿内,片上放两层滤纸,滴加足量的 5.0% 孔雀绿水溶液,将平皿盖好,置恒温培养箱55℃±1℃加热 30min。取出,去滤纸,用自来水冲去残留液;加0.5%沙黄水溶液,1min后水洗,待干后镜检。芽孢呈绿色,菌体呈红色。在显微镜(油镜)下镜检,当芽孢形成率达 90% 以上时,即可进行以下处理。否则,继续在室温下放置一定时间,直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。

      4、加 10.0mL 无菌蒸馏水于罗氏瓶中,以 L棒轻轻推刮下菌苔,吸出,再加入 5.0mL 无菌蒸馏水冲洗培养基表面,吸出。将两次吸出的菌悬液集中于含玻璃珠的无菌锥形烧瓶中,振摇 5min。

      5、将烧瓶置 45℃ 水浴锅中 24h,使菌自溶断链,分散成单个芽孢。

      6、用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液,清除琼脂凝块。

      7、将芽孢悬液置无菌离心管内,以 3000r/min 速度离心 30min。弃上清液,加蒸馏水吹吸使芽孢重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗,本步骤重复进行3遍。

      8、 将洗净的芽孢悬液放入含适量小玻璃珠的烧瓶内,80℃水浴锅中10min(或60℃水浴30min),以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后,摇匀分装后冷藏保存备用,有效使用期6个月。

      9、芽孢悬液在使用时,先进行活菌培养计数。

      10、 怀疑有杂菌污染时,以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定。

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