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细胞介导细胞毒作用检测法:时间分辩荧光分析法

发表时间:2021-07-12  |  点击率:159

时间分辩荧光分析法

1 )铕荧光检测法

标记靶细胞

1. EuCl3 的制备:称取 58.08mg Eu2 O3 ,用少量 1N HCl 搅拌至溶解,再用 1N NaOH 调节 pH 至 4.0 。加双蒸水配成 33 ~ 100mmol/L 的保存液, 4 ℃保存备用。
2. 用预冷的标记液将靶细胞浓度调整到 5 × 106 /ml ,加 50 μ l 10mg/ml 硫酸葡聚糖,置冰浴中 20 分钟,其间摇晃数次。
3. 加入 30 μ l 100mmol/L CaCl2 溶液终止反应 5 分钟。
4. 用含 2mmol/L CaCl2 的 RPMI-1640 培养液洗涤细胞 5 次。用含 10 %小牛血清的 RPMI-1640 培养液将靶细胞配成 5 × 104 /ml 。


检测方法

1. 在 96 孔圆底细胞培养板中加入靶细胞悬液,每孔加 100 μ l 。
2. 向各孔加 100 μ l 效应细胞,效应细胞与靶细胞的比例根据要求而定,通常为 5 : 1 ~ 20 : 1 。自然释放孔不加效应细胞只加 100 μ l 培养液,最大释放孔中加 100 μ l 0.5 % Triton X-100 。每个实验置三个复孔。
3. 置 37 ℃ 5 % CO2 的二氧化碳培养箱中培养 3 小时。
4. 从每孔吸出 20 μ l 上清液,对应加入另一块 96 孔酶标板中,向第二块板每孔加 200 μ l 增强液。室温中混合 5 分钟。在时间分辩荧光分析仪上测定各孔的荧光强度。同时做 EuCl3 的标准曲线:用 0.05mol/L pH7.0 柠檬酸缓冲液配制 10 倍梯度
5. 特异性杀伤活性计算: 杀伤活性(%)= [ (实验组荧光强度-自然释放组荧光强度) / (最大释放组荧光强度-自然释放组荧光强度) ] × 100 %


2 )用时间分辩荧光检测法同时检测 NK 细胞对三种靶细胞的细胞毒性

标记靶细胞

1. 取 107 靶细胞,用洗涤液(含 93mmol/L NaCl, 5mmol/L KCl 和 2mmol/L MgCl2 的 50mmol/L pH7.4 Hepes ,双蒸水配制)洗涤一次。小心吸去上清液,用 1ml 标记液(洗涤液中加 0.5mg/ml 磷酸葡聚糖和 0.06mmol/L Eu3+ 或 2mmol/L Sm3+ 或 0.2mol/L Tb3+ ,以及比镧系离子浓度高 5 倍的 DTPA )悬浮细胞。将细胞悬液置冰上 20 分钟,每 3 分钟上下吹打 1 次。
2. 加入 2ml 终止液(洗涤液中加 2mmol/L CaCl2 和 10mmol/L 葡萄糖),终止标记反应并使细胞膜上的孔隙封闭。 5 分钟后用终止液洗涤 3 次,用细胞培养液洗涤 3 次,每次洗涤时离心 500 × g 10 分钟。
3. 用细胞培养液将细胞配成 1.2 × 105 /ml 或 5 × 104 /ml 备用。

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